Jonathan M. 7 de enero de 2013 | Permalink
En un artículo anterior di una breve reseña de los complejos mecanismos moleculares que rigen la replicación del ADN. Ahora voy a centrar la atención de manera específica en la enzima de replicación ADN polimerasa.
La ADN polimerasa es la enzima responsable para sintetizar nuevas hebras de ADN, complementarias con la secuencia de la hebra patrón. La ADN polimerasa progresa a lo largo de la hebra patrón en una dirección 3′–5′, por cuanto precisa de un grupo 3′-OH preexistente para la adición de nucleótidos. La hebra hija es por consiguiente sintetizada en una dirección 5′–3′ (contraria a la dirección del movimiento de la polimerasa, ya que las dos hebras tienen una orientación antiparalela).
Hay seis diferentes familias de ADN polimerasas — A, B, C, D, X e Y (Rothwell y Waksman, 2005). Estas familias difieren entre sí en su diseño, estando especializadas para una diversidad de propósitos. Por ejemplo, la ADN polimerasa I, que se encuentra en la E. coli, pertenece a la familia de polimerasas A. Más allá de su función de terminar la replicación del ADN y de eliminar los cebos de ARN, la ADN polimerasa I contiene un dominio de exonucleasa 5′ a 3′, además del dominio de exonucleasa 3′ a 5′, que le permite eliminar nucleótidos tanto delante como detrás (se dirá más acerca de corrección de copias mediante dominios de exonucleasa) (Ishino et al., 1995). Las polimerasas en las familias B, C y D se conocen por su alta fidelidad (debido a su exonucleasa de corrección de copia 3′ a 5′), y se encuentran en eucariontes, bacterias y arqueas, respectivamente. La familia X (p. ej. las polimerasas eucariotas pol β, Pol σ, Pol λ, Pol μ) desempeña una función en reparación del ADN, llenando los vacíos creados durante el proceso (Yamtich y Sweasy, 2010). Mientras que la mayoría de las polimerasas no pueden replicar lesiones masivas pasadas en ADN dañado, la familia Y pueden replicar rebasándolas (Washington et al., 2010).
Las ADN polimerasas comparten generalmente un marco estructural común, con subdominios dedos, pulgar y palma que constituyen el dominio de la polimerasa. El diagrama que sigue, extraído de Beard y Wilson (2003), expone la estructura de la ADN polimerasa T7, revelando sus dos dominios, un dominio de polimerasa (en color) y un dominio de exonucleasa de corrección de copia (gris). El dominio polimerasa está comprendido de tres subdominios: dedos, pulgar y palma. El dominio dedo posiciona los nucleósidos trifosfatos entrantes en relación con la hebra patrón. Se cree que el dominio pulgar funciona en la procesividad, posicionado y translocación del ADN, manteniendo en su ligar el dúplex de ADN en elongación. La hoja plegada β (o lámina β) que comprende el dominio de la palma, es donde se encuentra el sitio activo de la enzima, que cataliza la transferencia de grupos fosforilos en la reacción de transferencia de fosforilos.
¿Cómo añade la ADN polimerasa nuevos nucleótidos a la hebra en elongación? El sitio activo de la polimerasa, que se encuentra en la lámina β que constituye el subdominio de la palma, cataliza una reacción de transferencia de fosforilo. Forma un enlace fosfodiéster entre el grupo hidroxilo 3′ al final de la hebra patrón con el grupo fosforilo 5′ del nucleótido. El primer paso en el proceso es un ataque nucleofílico sobre el α-fosfato del nucleósido trifosfato entrate por parte del OH 3′ de la cadena en crecimiento. Esta reacción libera pirofosfato (PPi). Dentro del sitio activo hay dos residuos de aspartato conservados. Los iones de magnesio en los grupos carboxilados de estos aspartatos son vitales para la reacción. Estos grupos carboxilados coordinan los iones de magnesio y facilitan su participación en la catálisis sujetándolos en la orientación correcta. Uno de los dos iones de magnesio activa el grupo OH 3′ del nucleótido terminal. El otro es responsable de la estabilización de una carga negativa en desarrollo en el oxígeno saliente sobre el trifosfato del nucleósido entrante. Las cadenas laterales en la hélice alfa en el dominio dedo interaccionan con el trifosfato entrante también para estabilizarlo. La hidrólisis del pirofosfato liberado en este proceso genera la energía exigida para propulsar la reacción hacia adelante. Para una reseña más detallada de los mecanismos involucrados, remito a los lectores a Rothwell y Waksman (2005).
El proceso mediante el que la ADN polimerasa selecciona el nucleótido correcto se comprende menos. Para un análisis del estado de esta cuestión, remito a los lectores a Markiewicz et al. (2012).
Como decía en mi anterior entrada, se cree que la velocidad a la que la ADN polimerasa replica el ADN es una cantidad desmesurada de 749 nucleótidos por segundo (McCarthy et al., 1976) y se cree que la tasa de errores para polimerasas precisas se encuentra en alrededor de 10^-7 y 10^-8, en base de estudios de la replicación de la E. coli y de los bacteriófagos (Schaaper, 1993). Esta fidelidad tan extraordinariamente elevada se consigue por medio de un también extraordinario dispositivo de lectura y corrección de copia incorporado en la enzima, que comprueba la identidad de los nucleótidos tanto durante como después de la polimerización.
El primer nivel de monitorización ocurre debido a que, cuando la base está emparejada con la hebra complementaria (A con T, o C con G), los nucleótidos correctos ajustan de manera precisa en el sitio activo, mientras que los nucleótidos que están incorrectamente emparejados exhibirán una geometría diferente y no ajustarán con tanta precisión en el sitio activo (Johnson y Beese, 2004).
Sin embargo, en ocasiones el primer nivel de monitorización fallará en prevenir la entrada de un nucleótido incorrecto. Pero, felizmente, hay también un segundo nivel de corrección de copia. Además del sitio activo de la polimerasa, la ADN polimerasa posee un sitio activo exonucleasa 3′ a 5′, que puede escindir un nucleótido incorrecto desde el extremo 3′ de la hebra de ADN en elongación antes de la síntesis del nucleótido posterior. Cuando se incorpora por error un nucleótido incorrecto, la tasa de actividad de la polimerasa se retrasa significativamente. Unos estudios han expuesto que la presencia de un desemparejado puede reducir la eficiencia de la polimerasa de posterior elongación por un factor desde cien hasta un millón (Kunkel y Bebenek, 2000; Goodman et al., 1993; Echols y Goodman, 1991). Esto da suficiente tiempo para una desnaturalización espontánea del ADN en el extremo 3′, lo que facilita la transferencia del extremo 3′ con el nucleótido desemparejado al sitio exonucleasa 3′ de la polimerasa, que cataliza la eliminación de múltiples nucleótidos desde el extremo 3′ de la hebra de ADN. El extremo 3′ es posteriormente posicionado de vuelta en el sitio activo de la polimerasa, y la polimerasa puede luego proseguir su actividad de síntesis de ADN en la dirección 5′ a 3′.
La siguiente animación desvela este extraordinario proceso en marcha:
Pero se debería observar que no todas las polimerasas poseen una exonucleasa intrínseca de corrección de copia. Por ejemplo, las polimerasas que pertenecen a la familia Y tienden a ser significativamente menos precisas (Friedberg et al., 2001). Los miembros de esta familia «carecen de una nucleasa intrínseca de corrección de copia, exhiben una baja procesividad, replican el ADN con baja fidelidad, y se cree que ayudan a complejos de replicación atascados en lesiones del ADN» (Beard et al., 2002).
La ADN polimerasa es solamente uno de numerosos complejos proteínicos que desempeñan una importante función en la replicación del ADN. Una reseña general de la maquinaria involucrada en el proceso de replicación da razones más que suficientes para justificar una inferencia de designio. Al ir explorando y examinando los subcomponentes individuales que constituyen la maquinaria de replicación del ADN de la célula, se hace cada vez más difícil ignorar el argumento del designio. En posteriores artículos continuaré esta exploración de los intrincados procesos moleculares que subyacen a la biosíntesis del ADN.
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Fuente: Evolution News – Replicating DNA with Extraordinary Fidelity: Meet DNA Polymerase 7/01/2013
Redacción: Jonathan © 2013 – http://www.evolutionnews.org
Traducción y adaptación: Santiago Escuain, publicado en sedin-notas.blogspot.com.es
© SEDIN 2013 – http://www.sedin.org
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Publicado por Santiago Escuain para SEDIN – NOTAS y RESEÑAS el 2/21/2013 09:36:00 p.m.
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